В мире ослепленных тьмой может солнцем показаться пламя от свечи
16:06
Прорывы в генетике
«Перед началом работы, для того, чтобы убедиться, что в качестве шаблона они имеют не содержащую ошибок последовательность бактериальной хромосомы, ученые провели повторное секвенирование генома обычного штамма Mycoplasma genitalium. После получения окончательной версии генома авторы химическими методами синтезировали фрагменты ДНК, из которых впоследствии построили 101 «модуль» размером 5-7 т.п.н.. Для того, чтобы синтетический геном можно было без труда отличить от естественного, в него встроили своего рода «водяные знаки» – короткие последовательности ДНК, кодирующие информацию, не встречающуюся в природе. Еще одним отличием синтетического генома от естественного является отсутствие генов, обеспечивающих инфекционность микроорганизма. При создании модулей авторы сотрудничали преимущественно с занимающейся синтезом ДНК компанией Blue Heron Technology, а также компаниями DNA 2.0 и GENEART.
После этого исследователи разработали 5-ступенчатый процесс последовательной сборки модулей в более крупные фрагменты. На первом этапе объединение четверок модулей позволило получить 25 фрагментов ДНК, каждый из которых состоял примерно из 24 т.п.н. Эти фрагменты клонировали в бактериях Escherichia coli (кишечной палочки, одной из главных рабочих лошадок молекулярных биологов) для получения количества ДНК, достаточного для проведения последующих этапов и контроля правильности последовательности.
Следующий этап заключался в комбинировании полученных фрагментов в 8 блоков по 72 т.п.н. Эти более крупные фрагменты также клонировали с помощью E.coli, после чего объединили их попарно. В результате получилось 4 крупных фрагмента, каждый из которых содержал около 144000 пар нуклеотидных оснований и представлял собой четвертую часть генома микоплазмы.
На этом этапе работы авторы обнаружили, что клетки E.coli не могут синтезировать фрагменты ДНК необходимого им размера и, в поисках замены, обнаружили, что дрожжи способны не только клонировать крупные фрагменты ДНК, но и объединять их между собой с помощью механизма гомологичной рекомбинации. В результате четвертинки генома были успешно объединены в одно целое, содержащее более 580 000 пар нуклеотидных оснований. Полученную хромосому снова секвенировали для подтверждения точности химической структуры.
Синтетическая хромосома M.genitalium JCVI-1.0 имеет молекулярную массу 360,110 килодальтон (kDa). Напечатанная на бумаге шрифтом в 10 пунктов последовательность синтетической хромосомы занимает 147 страниц.»(с)
www.balticstar.ru/perviy_iskusstvenniy_bakteria...
После этого исследователи разработали 5-ступенчатый процесс последовательной сборки модулей в более крупные фрагменты. На первом этапе объединение четверок модулей позволило получить 25 фрагментов ДНК, каждый из которых состоял примерно из 24 т.п.н. Эти фрагменты клонировали в бактериях Escherichia coli (кишечной палочки, одной из главных рабочих лошадок молекулярных биологов) для получения количества ДНК, достаточного для проведения последующих этапов и контроля правильности последовательности.
Следующий этап заключался в комбинировании полученных фрагментов в 8 блоков по 72 т.п.н. Эти более крупные фрагменты также клонировали с помощью E.coli, после чего объединили их попарно. В результате получилось 4 крупных фрагмента, каждый из которых содержал около 144000 пар нуклеотидных оснований и представлял собой четвертую часть генома микоплазмы.
На этом этапе работы авторы обнаружили, что клетки E.coli не могут синтезировать фрагменты ДНК необходимого им размера и, в поисках замены, обнаружили, что дрожжи способны не только клонировать крупные фрагменты ДНК, но и объединять их между собой с помощью механизма гомологичной рекомбинации. В результате четвертинки генома были успешно объединены в одно целое, содержащее более 580 000 пар нуклеотидных оснований. Полученную хромосому снова секвенировали для подтверждения точности химической структуры.
Синтетическая хромосома M.genitalium JCVI-1.0 имеет молекулярную массу 360,110 килодальтон (kDa). Напечатанная на бумаге шрифтом в 10 пунктов последовательность синтетической хромосомы занимает 147 страниц.»(с)
www.balticstar.ru/perviy_iskusstvenniy_bakteria...
17.07.2009 в 15:04